Чл. 43

Чл. 43.(1) Територията на Република България или регион от нея, обявени за официално свободни от ЕЛГ, запазват статуса си, ако:

1. на всички заклани животни е извършен следкланичен преглед, при който всички открити тумори, които биха могли да са причинени от вируса на ЕЛГ, са изпратени за лабораторно изследване;
2. (изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) БАБХ информира ЕК за всички случаи на ЕЛГ, които са се появили в отделните региони;
3. всички животни, които са реагирали положително на изследванията за ЕЛГ, са заклани и стадата, от които те произхождат, са поставени под ограничения до възстановяване на статуса им;
4. (изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) всички животни, които са на възраст над 24 месеца, се изследват веднъж през първите 5 години след получаване на статуса на официално свободна територия от ЕЛГ или през първите 5 години след получаване на този статус БАБХ гарантира с достоверност от 99%, че по-малко от 0,2% от стадата са заразени;
5. (изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) през последните 3 години не е имало нито един случай на ЕЛГ в стада с общ брой от 10 000 говеда и БАБХ ежегодно извършва серологично изследване на 1% от всички говеда над 12-месечна възраст в избрани случайно стада.

(2) Статусът на територията на Република България или на регион от нея на официално свободни от ЕЛГ се отменя, ако в резултат на изследванията по ал. 1 има информация за промяна на ситуацията по отношение на ЕЛГ. (3) Отнетият статус на Република България или регион от нея на официално свободни от ЕЛГ се възстановява от ЕК при изпълнение на изискванията на тази наредба.

Допълнителни разпоредби § 1. За целите на тази наредба се прилагат следните дефиниции:

1. "Болести, задължителни за обявяване" са болестите, посочени вприложение № 5.
2. "Говеждо стадо, официално признато за свободно от бруцелоза" е говеждо стадо, отговарящо на условията почл. 29, ал. 2.
3. "Говеждо стадо, официално свободно от ензоотична левкоза по говедата (ЕЛГ)" е говеждо стадо, което отговаря на условията почл. 40, ал. 1.
4. "Говеждо стадо, официално признато за свободно от туберкулоза" е говеждо стадо, отговарящо на условията почл. 23.
5. "Животни за клане" са говеда от говежди животински видове (включително и такива от вида Bison bison и Bubalus bubalus) или свине, предназначени за транспортиране до кланица или събирателен център, от който животните може да бъдат насочени само и единствено за клане.
6. "Животни за развъждане и продукция"са животни от говежди животински видове (включително и такива от вида Bison bison и Bubalus bubalus) или свине, различни от посочените в т. 2, включително и такива, предназначени за разплод, производство на мляко или месо, за работа, за панаири или изложби, с изключение на животните, участващи в културни или спортни мероприятия.
7. (изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) "Одобрен ветеринарен лекар" е регистриран ветеринарен лекар, сключил договор с ОДБХ за изпълнение на мерките по програмите за надзор и ликвидиране на болести по животните и държавната профилактична програма съгласночл. 46е ЗВДв съответствие с разпоредбите начл. 20, ал. 2от наредбата.
8. "Официален ветеринарен лекар" е ветеринарен лекар, определен съгласночл. 9, ал. 1 и 2 ЗВД.
9. (изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) "Регион" е част от територията на Република България с площ от най-малко 2000 км2, инспектирана от БАБХ, с включена в нея най-малко една административна единица - област.
10. "Свободно от бруцелоза говеждо стадо" е говеждо стадо, отговарящо на условията почл. 33.
11. "Стадо" е едно животно или група животни, отглеждани в един животновъден обект, в качеството му на епизоотична единица. Ако в един животновъден обект се намират повече от едно стада, всяко едно от тях формира отделна единица и има същия здравен статус.
12. "Събирателен център" е животновъден обект, в които се събират говеда и свине, произхождащи от различни животновъдни обекти, с цел образуване на партида, предназначена за търговия. В събирателните центрове се извършва търговия, като се спазват изискванията начл.15, ал. 1.
13. "Територията на Република България или регион от нея, официално признат за свободен от бруцелоза" е територията на Република България или регион от нея, отговарящи на условията почл. 37.
14. "Територията на Република България или регион от нея, официално свободни от ЕЛГ" е територията на Република България или регион от нея, отговарящи на условията почл. 43.
15. "Територията на Република България или регион от нея, официално признат за свободен от туберкулоза" е територията на Република България или регион от нея, отговарящи на условията почл. 27.
16. "Търговец" е физическо или юридическо лице, което купува и/или продава животни с търговска цел, директно или индиректно, осъществяващо редовен оборот от тази дейност, което в период от максимум 30 дни от закупуването на животните ги препродава или променя местопребиваването им от местата на техния първоначален престой в други места или помещения, които не са негова собственост, съгласночл. 17.

§ 2. За целите на тази наредба се използват и прилагат дефинициите, посочени в допълнителните разпоредби наНаредба № 34 от 2006 г. за изискванията за извършване на проверки на животни, зародишни продукти, странични животински продукти и продукти, получени от тях, при обмен между Република България и държавите - членки на ЕС (ДВ, бр. 30 от 2006 г.), въвеждащаДиректива 90/425на Съвета от 26 юни 1990 г. относно ветеринарните и зоотехническите проверки, приложими при търговията на Общността с определени видове живи животни и продукти с оглед завършване изграждането на вътрешния пазар (обнародвана в ОВ, бр. L 224 от 1990 г.) ичлен 2 от Регламент № 1/2005от 22 декември 2004 г. относно защитата на животните по време на транспортиране и свързаните с това операции и за изменение на директиви 64/432/ЕИО и 93/119/ЕО и Регламент (ЕО) № 1255/97.

§ 3. (Изм. и доп. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) Тази наредба въвежда изискванията наДиректива 64/432на Съвета от 26 юни 1964 г. относно проблеми, свързани със здравето на животните, които засягат търговията в Общността с говеда и свине (обнародвана в OB, бр. L 121, 29.VII.1964 г., стр. 1977 - 2012 (DE, FR, IT, NL); специално българско издание: глава 03, том 01, стр. 10 - 31), изискванията на чл. 1 отДиректива 2008/73/ЕОна Съвета от 15 юли 2008 г. за опростяване на процедурите по вписване и публикуване на информация във ветеринарната и зоотехническата област и за изменение на директиви 64/432/ЕИО, 77/504/ЕИО, 88/407/ЕИО, 88/661/ЕИО, 89/361/ЕИО, 89/556/ЕИО, 90/426/ЕИО, 90/427/ЕИО, 90/428/ЕИО, 90/429/ЕИО, 90/539/ЕИО, 91/68/ЕИО, 91/496/ЕИО, 92/35/ЕИО, 92/65/ЕИО, 92/66/ЕИО, 92/119/ЕИО, 94/28/EO, 2000/75/EO, Решение 2000/258/ЕО и директиви 2001/89/EO, 2002/60/ЕО и 2005/94/EO, обнародвана в ОВ, бр. L 219 от 2008 г. и изискванията наДиректива 2014/64/ЕСна Европейския парламент и на Съвета от 15 май 2014 г. за изменение на Директива 64/432/ЕИО на Съвета по отношение на компютърните бази данни, които са част от мрежите за надзор в държавите-членки (ОВ, L 189 от 27.06.2014 г.) и осигурява прилагането наРешение за изпълнение (ЕС) 2015/819на Комисията от 22 май 2015 г. за изменение на Приложение Е към Директива 64/432/ЕИО на Съвета по отношение на формата на образците на здравни сертификати за търговия в рамките на Съюза с говеда и свине (ОВ, L 129 от 27.05.2015 г.).

Заключителни разпоредби § 4. Наредбата се издава на основаниечл. 54 ЗВД.

§ 5. Наредбата отменяНаредба № 5 от 2008 г. за здравните изисквания към говеда и свине при придвижването или транспортирането им между Република България и държавите - членки на Европейския съюз, и за определяне на здравния статус на районите и обектите, от които произхождат, и системите за надзор(ДВ, бр. 31 от 2008 г.).

§ 6. (Изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.) Изпълнението на наредбата се възлага на изпълнителния директор на Българската агенция за безопасност на храните.

§ 7. Наредбата влиза в сила от обнародването й в "Държавен вестник".

НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 4 ОТ 2010 Г. ЗА ЗДРАВНИТЕ ИЗИСКВАНИЯ КЪМ ГОВЕДА И СВИНЕ ПРИ ТРАНСПОРТИРАНЕТО ИМ МЕЖДУ РЕПУБЛИКА БЪЛГАРИЯ И ДРУГИТЕ ДЪРЖАВИ - ЧЛЕНКИ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ, И ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЗДРАВНИЯ СТАТУС НА РАЙОНИТЕ И ОБЕКТИТЕ, ОТ КОИТО ПРОИЗХОЖДАТ ТЕЗИ ЖИВОТНИ Въведете текст на Долепка 0 Заключителни разпоредбиКЪМ НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 4 ОТ 2010 Г. ЗА ЗДРАВНИТЕ ИЗИСКВАНИЯ КЪМ ГОВЕДА И СВИНЕ ПРИ ТРАНСПОРТИРАНЕТО ИМ МЕЖДУ РЕПУБЛИКА БЪЛГАРИЯ И ДРУГИТЕ ДЪРЖАВИ - ЧЛЕНКИ НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ, И ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ЗДРАВНИЯ СТАТУС НА РАЙОНИТЕ И ОБЕКТИТЕ, ОТ КОИТО ПРОИЗХОЖДАТ ТЕЗИ ЖИВОТНИ (ОБН. - ДВ, БР. 91 ОТ 2015 Г., В СИЛА ОТ 24.11.2015 Г.) § 8.Наредбатавлиза в сила от деня на обнародването й в "Държавен вестник" с изключение на§ 2, т. 2, която влиза в сила от 18 юли 2019 г.

Приложение № 1 къмчл. 4, ал. 1 (Изм. - ДВ, бр. 91 от 2015 г., в сила от 24.11.2015 г.)

Приложение № 2 къмчл. 23, ал. 1

1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА АГЕНТА

Наличието на Mycobacterum bovis (M.bovis), агент на говежда туберкулоза, в клинични и постмортални проби може да бъде демонстрирано чрез изследване на оцветени намазки или имунопероксидазни техники и потвърдено чрез култивиране на организма върху първично изолирана среда. Патологичният материал за потвърждаване на M.bovis следва да бъде взет от анормални лимфни възли и паренхиматозни органи, като бели дробове, черен дроб, далак и други. В случаите, когато животното не показва патологични лезии, следва да бъдат събрани проби от ретрофарингеални, бронхиални, медиастинални, супрамамарни, мандибуларни и някои мезентерични лимфни възли и далак за изследване и култура. Идентификацията на изолати може да се направи обикновено чрез определяне на културални и биохимични свойства. Може също така да се използва полимеразна верижна реакция (PCR) за определяне на М.tuberculosis комплекс. Техниките за анализ на ДНК могат да се окажат по-бързи и по-надеждни от биохимичните методи за диференциация на Mycobacterium bovis от М. tuberculosis комплекс. Генетичните отпечатъци позволяват разграничаване между различните щамове на M.bovis и ще позволят да се опишат картините на произхода, предаването и разпространението на M.bovis. Използваните техники и среди, тяхната стандартизация и интерпретация на резултатите трябва да отговарят на определеното от Световната организация поздравеопазванена животните (OIE) в Наръчник за стандарти за диагностични тестове и ваксини, четвърто издание, 2000 г., глава 2.3.3 (туберкулоза по говедата).

1. ТУБЕРКУЛИНОВ КОЖЕН ТЕСТ

Туберкулин (пречистени протеинови деривати), който отговаря на стандартите, установени по-долу в параграф 2.1, се използва за провеждане на официален туберкулинов кожен тест съгласно процедурите, посочени в параграф 2.2. 2.1. Стандарти за туберкулин (говежди и птичи) 2.1.1. Дефиниция Туберкулинов пречистен протеинов дериват (туберкулин PPD, говежди и птичи) е препарат, получен от топлинно обработени продукти на растеж и лизис на Mycobacterium bovis или Mycobacterium avium (ако е уместно), който е в състояние да развие закъсняла свръхчувствителност в животно с повишена чувствителност към микроорганизми от същия вид. 2.1.2. Производство Получава се от водоразтворими фракции, получени чрез нагряване със свободно подавана пара и последващо филтруване на култури от M.bovis или M.avium (както е уместно), отгледани в течна синтетична среда. Активната фракция на филтрата, състояща се главно от протеин, е изолирана чрез утаяване, промиване и повторно разтваряне. Може да бъде добавено антимикробно консервиращо вещество, което не предизвиква погрешни позитивни реакции, като например фенол. Крайният стерилен препарат, свободен от микобактерии, се разпределя асептично в стерилни, защитени от замърсяване стъклени контейнери, които се затварят така, че да бъдат предпазени от замърсявания. Препаратът може да се лиофилизира. 2.1.3. Идентификация на продукта Инжектира се серия от равни дози интрадермално на различни места на морски свинчета албиноси с подходящо повишена чувствителност, всяко тежащо не по-малко от 250 g. След 24 h до 28 h се появява реакция под формата на едематозно подуване с еритема със или без некроза на местата на инжектиране. Размерът и сериозността на реакцията варира в зависимост от дозата. Морските свинчета, които не са с повишена чувствителност, не показват реакция на подобни инжекции. 2.1.4. Тестове 2.1.4.1. pH: рН е 6,5 до 7,5. 2.1.4.2. Фенол: ако изследваният препарат съдържа фенол, неговата концентрация не е повече от 5 g/l. 2.1.4.3. Сенсибилизиращ ефект: използва се група от три морски свинчета, които не са третирани с никакъв материал, който може да взаимодейства с теста. Три пъти на интервали от пет дни на всяко морско свинче се инжектира интрадермално доза от изследвания препарат, еквивалентна на 500 IU в 0,1 ml. От 15 до 21 дни след третата инжекция се инжектира интрадермално същата доза (500 IU) в тези животни и в контролна група от три морски свинчета със същото тегло и които преди това не са били инжектирани с туберкулин. 24 до 28 часа след последното инжектиране реакциите на двете групи не се различават съществено. 2.1.4.4. Токсичност: използват се две морски свинчета, всяко от които тежи не по-малко от 250 g, които не са третирани преди това с никакъв материал, който може да попречи на теста. Във всяко морско свинче се инжектира подкожно 0,5 ml от изследвания препарат. Животните се наблюдават за период от седем дни. През изследвания период не се проявяват анормални ефекти. 2.1.4.5. Стерилност: отговаря на теста за стерилност, предписан в монографията върху ваксините за ветеринарна употреба, 4-то издание, 2002 г., на Европейската фармакопея. 2.1.5. Потенция Потенцията на туберкулиновия пречистен протеинов дериват (говеждо и птиче) се определя чрез сравнение на реакциите, предизвикани в морски свинчета с повишена чувствителност чрез интрадермална инжекция на серии от разреждания на изследвания препарат, с тези, произведени чрез известни концентрации на референтен препарат на туберкулинов (говежди и птичи, ако е подходящо) пречистен протеинов дериват, калибрирано в международни единици. За да се тества потенцията, се сенсибилизират не по-малко от девет морски свинчета албиноси, всяко тежащо от 400 g до 600 g, с дълбока интрамускулна инжекция от 0,0001 mg влажна маса на живи M.bovis от щам AN5, суспендирана в 0,5 ml 9 g/l разтвор на натриев хлорид R за говежди туберкулин, или подходяща доза инактивирани или живи M.avium за птичи туберкулин. След не по-малко от четири седмици след сенсибилизирането, хълбоците им се обръсват, за да се направи място за не повече от четири инжекции от всяка страна. Приготвят се разреждания на изследвания препарат и на референтния препарат при използване на изотоничен фосфатен буфер (рН 6,5 - 7,5), съдържащ 0,005 g/l полисорбат 80 R. Използват се не по-малко от три дози от референтния препарат и по-малко от три дози от препарата, който трябва да бъде изследван. Дозите се избират така, че направените лезии имат диаметър не по-малък от 8 mm и не по-голям от 25 mm. Разрежданията се разпределят безразборно по отношение на местата във вид на квадрат, в който няма повторение на символите. Всяка доза с постоянен обем от 0,1 ml или 0,2 ml се инжектира интрадермално. След 24 до 28 часа се измерва диаметърът на всяка лезия и се изчислява резултатът от теста, като се използват обичайните статистически методи и като се приема, че диаметрите на лезиите са правопропорционални на логаритъма на концентрацията на туберкулина. Тестът не е валиден само когато доверителната граница на грешката (Р = 0,95) не е по-малка от 50% и не е повече от 200% на изчислената потенция. Изчислената потенция е не по-малко от 66% и не повече от 150% от установената потентност за говеждия туберкулин. Изчислената потенция е не по-малко от 75% и не повече от 133% от установената потентция за птичи туберкулин. Установената потенция е не по-малка от 20 000 IU/ml и за двата туберкулина (говежди и птичи). 2.1.6. Съхранение Съхранява се защитен от светлина при температура от 5 ± 3°C. 2.1.7. Етикетиране Етикетът съдържа:

• потенцията в международни единици за милилитър;
• наименованието и количество на всяко добавено вещество;
• за лиофилизирани препарати:
• наименованието и обема на възстановяващата течност, която трябва да бъде добавена;
• че продуктът следва да бъде използван незабавно след възстановяването.

2.2. Тестови процедури 2.2.1. Като официален интрадермален туберкулинов тест се признава следното:

• единичен интрадермален тест: този тест изисква единична инжекция на говежди туберкулин;
• интрадермален сравнителен тест: този тест изисква една инжекция на говежди туберкулин и една инжекция на птичи туберкулин, направени едновременно.

2.2.2. Инжектираната доза от туберкулин е:

• не по-малко от 2000 IU говежди туберкулин;
• не по-малко от 2000 IU птичи туберкулин.

2.2.3. Обемът на всяка инжектирана доза не надвишава 0,2 ml. 2.2.4. Туберкулиновите тестове се провеждат чрез инжектиране на туберкулин/и в кожата на шията. Местата на инжекциите се намират на границата между предната и средната третини на шията. Когато на едно животно се инжектират и говежди, и птичи туберкулин, мястото за инжектиране на птичи туберкулин е на разстояние около 10 cm от горния край на шията и мястото за инжектиране на говежди туберкулин трябва да бъде на разстояние около 12,5 cm по-ниско на линия, приблизително успоредна на линията на рамото или на различни страни на шията; при млади животни, при които няма достатъчно място за достатъчно разделяне на инжектиранията на едната страна на шията, една инжекция се прави от двете страни на шията на идентични места в центъра на средната трета на шията. 2.2.5. Техниката на туберкулиновото тестване и интерпретирането на реакциите са, както следва: 2.2.5.1. Техника: Инжектираните места се стрижат и почистват. Гънка от кожата от всяко остригано място се хваща с палеца и показалеца, измерва се с дебеломер и се записва. След това дозата туберкулин се инжектира чрез метод, който гарантира, че туберкулинът е въведен интрадермално. Използва се къса стерилна игла с косо срязан отвън ръб и градуирана спринцовка, напълнена с туберкулин, за вкарване под наклон в по-дълбоките слоеве на кожата. Правилното инжектиране се потвърждава чрез напипване на малка граховидна подутина на местата на инжектиране. Дебелината на кожната гънка на всяко инжектирано място се мери отново 72 часа (± 4 часа) след инжектирането и се записва. 2.2.5.2. Интерпретация на реакциите Интерпретацията на реакциите се основава на клиничните наблюдения и записаното увеличение/я на дебелината на кожната гънка на местата на инжектиране 72 часа след инжектирането на туберкулина/ите: а) Отрицателна реакция: ако се наблюдава само ограничено подуване с увеличение не повече от 2 mm на дебелината на кожната гънка без клинични признаци като дифузен или екстензивен едем, ексудация, некроза, болка или възпаление на лимфните влакна в тази област или на лимфните възли. б) Неопределена реакция: ако не се наблюдават клинични признаци, както е упоменато в буква "а", и ако увеличаването на дебелината на кожната гънка е повече от 2 mm и по-малко от 4 mm. в) Положителна реакция: ако не се наблюдават клинични признаци като тези, упоменати в буква "а", или ако увеличаването на дебелината на кожната гънка на мястото на инжектиране е повече от 4 mm. 2.2.5.3. Интерпретацията на официалните интрадермални туберкулинови тестове са, както следва: 2.2.5.3.1. Единичен интрадермален тест: а) положителна: реакция на говедото, както е определена в параграф 2.2.5.2, буква "в"; б) неопределена: реакция на говедото, както е определена в параграф 2.2.5.2, буква "б"; в) отрицателна: реакция на говедото, както е описана в параграф 2.2.5.2, буква "а". Животните с неопределен резултат от единичното интрадермално изследване се подлагат на друго изследване след минимум 42 дни. Животните, които не са отрицателни след второто изследване, се счита, че показват положителна реакция на изследването. Животните, които са положителни на единичното интрадермално изследване, могат да бъдат подложени на диференциално изследване, ако има съмнение за грешна положителна реакция или неспецифична реакция. 2.2.5.3.2. Интрадермално диференциално изследване за установяване и поддържане на статуса на стадо, официално свободно от туберкулоза: а) положителен: положителна говежда реакция, която е по-голяма с повече от 4 mm от реакцията на птичия туберкулин или наличието на клинични признаци; б) неопределен: положителна или неопределена говежда реакция, която е по-голяма от 1 до 4 mm от реакцията на птичия туберкулин и липсват клинични признаци; в) отрицателен: отрицателна говежда реакция или положителна или неопределена говежда реакция, която е еднаква или по-малка от положителна, или неопределена реакция на птичия туберкулин и липса на клинични признаци и в двата случая. Животни, които са с неопределени реакции на интрадермално диференциално изследване, се подлагат на друго изследване след минимум 42 дни. Животни, които не са отрицателни на второто изследване, се считат за положителни. 2.2.5.3.3. Статусът на стадо, официално свободно от туберкулоза, може да бъде отнет и не трябва да се позволява на животни от стадото да се търгуват в рамките на Общността за времето, за което статусът на следните животни е отнет: а) животни, които са считани за неопределени относно единичното интрадермално туберкулиново изследване; б) животни, които са считани за положителни на единичното интрадермално изследване, но очакват повторно изследване с диференциална туберкулинизация; в) животни, които са считани за неопределени на диференциалното изследване; 2.2.5.3.4 Когато законодателството на Общността изисква животните да бъдат тествани с интрадермално изследване преди транспортирането им, изследването се интерпретира така, че никое животно, което показва увеличение на дебелината на кожната гънка повече от 2 mm или наличие на клинични признаци, не може да бъде предмет на търговия вътре в Общността. 2.2.5.3.5. За да позволи откриване на максимален брой инфектирани и заразени животни в стадото или в района, държавите членки могат да изменят критериите за интерпретиране на изследването с цел постигане на по-голяма чувствителност на изследването относно всички неопределени реакции, посочени в 2.2.5.3.1, буква б) и 2.2.5.3.2, буква б) като положителни реакции.

1. ДОПЪЛНИТЕЛНО ТЕСТВАНЕ

За да позволи откриването на максимален брой инфектирани и заразени животни в стадото или в региона, държавите членки могат да разрешат употребата на гама-интерферонови анализи, посочени в Наръчника за стандарти за диагностични тестове и ваксини, 4-то издание, 2000 г., глава 2.3.3 (туберкулоза по говедата) на Световната организация по здравеопазване на животните (OIE), в допълнение към туберкулиновото изследване.

1. НАЦИОНАЛНА РЕФЕРЕНТНА ЛАБОРАТОРИЯ

4.1. Задачи и задължения Националната референтна лаборатория, определена в съответствие счлен 10, отговаря за официалното изследване на туберкулини или реактиви, посочени съответно в параграфи 2 и 3, в техните съответни държави членки, за да гарантират, че всеки един от тези туберкулини или реактиви съответства на стандартите, посочени съответно в точка 2.1 и параграф 3.

Приложение № 3 къмчл. 29, ал. 2, т. 3

1. ИДЕНТИФИКАЦИЯ НА АГЕНТА

Демонстрацията чрез променено киселиноустойчиво или имунноспецифично оцветяване на наличието на организми с морфология на Brucella в абортиран материал, вагинални секреции или мляко показва възможно наличие на бруцелоза, особено ако е потвърдено от серологични изследвания. Методът на полимеразната верижна реакция (PCR) предоставя допълнителни средства за откриване. Когато е възможно, Brucella spp. следва да бъдат изолирани по култури, като се използват обикновени или селективни среди от утробни секреции, абортирани ембриони, секреции от вимето или от определени тъкани, като лимфни възли и мъжки и женски репродуктивни органи. След изолирането видовете и биоварът се идентифицират чрез фаголиза и/или тестове с окислителен метаболизъм според биохимични и серологични критерии и критерии, свързани с културите. PCR може да служи както за допълнителен метод, така и за метод за определяне на биотипа, основан на специфични геномни поредици. Използваните техники и среди, тяхната стандартизация и интерпретирането на резултатите трябва да отговарят на определеното от Наръчника по диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, шесто издание, 2008 г., глава 2.4.3 (бруцелоза по говедата), глава 2.7.2 (бруцелоза по козите и овцете) и глава 2.8.5 (бруцелоза по свинете).

1. ИМУНОЛОГИЧНИ ТЕСТОВЕ

2.1. Стандарти 2.1.1. За приготвянето на всички антигени, използвани в роз бенгал теста (RBT), в серум аглутинационния тест (SAT), в теста за фиксиране на комплемента (CFT) и в млечния ринг тест (MRT), трябва да се използва Weybridge щам № 99 или USDA щам 1119-3 на Brucella abortus биовар 1. 2.1.2. Стандартният референтен серум за RBT, SAT, CFT и MRT е международният стандартен референтен серум на OIE (OIEISS), наричан преди втори международен стандартен серум на СЗО срещу Brucella abortus (ISAbS). 2.1.3. Стандартните референтни серуми за имуноензимните методи (ЕЛАЙЗА) са:

• серумът OIEISS;
• слабоположителният стандартен серум ЕЛАЙЗА на OIE (OIEELISAWPSS);
• силноположителният стандартен серум ЕЛАЙЗА на OIE (OIEELISASPSS);
• отрицателният стандартен серум ЕЛАЙЗА на OIE (OIEELISANSS).

2.1.4. Стандартните референтни серуми за флуоресцентно-поляризационните тестове (FPA) са:

• слабоположителният стандартен серум ЕЛАЙЗА на OIE (OIEELISAWPSS);
• силноположителният стандартен серум ЕЛАЙЗА на OIE (OIEELISASPSS);
• отрицателният стандартен серум ЕЛАЙЗА на OIE (OIEELISANSS).

2.1.5. Стандартните серуми, описани в подточки 2.1.3 и 2.1.4, се доставят от референтната лаборатория на Общността за бруцелоза или Агенцията за ветеринарните лаборатории (VLA), Уейбридж, Обединеното кралство. 2.1.6. OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS и OIEELISANSS са международни първични стандарти, от които във всяка държава членка трябва да се установят вторични референтни национални стандартни серуми (работни стандарти) за всеки тест, посочен в подточка 2.1.1. 2.2. Имуноензимни методи (ЕЛАЙЗА) или други свързващи тестове за откриване на бруцелоза по говедата в серум или мляко 2.2.1. Материали и реагенти Използваната техника и интерпретирането на резултатите трябва да са одобрени в съответствие с принципите, заложени в Наръчника по диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, шесто издание, 2008 г., глава 1.1.4, и трябва да включват поне лабораторни и диагностични изследвания. 2.2.2. Стандартизация на теста 2.2.2.1. Стандартизация на тестоватапроцедураза индивидуални серумни проби: а) предварителният разтвор от 1/150 (1) от OIEISS или предварителният разтвор от 1/2 от OIEELISAWPSS, или предварителният разтвор от 1/16 от OIEELISASPSS, реализиран в отрицателен серум (или в смес от отрицателни серуми), трябва да доведе до положителна реакция; б) предварителният разтвор от 1/600 от OIEISS или предварителният разтвор от 1/8 от OIEELISAWPSS, или предварителният разтвор от 1/64 от OIEELISASPSS, реализиран в отрицателен серум (или в смес от отрицателни серуми), трябва да доведе до отрицателна реакция; в) OIEELISANSS трябва да води винаги до отрицателна реакция. 2.2.2.2. Стандартизация на тестоватапроцедураза серумни проби под формата на смеси: а) предварителният разтвор от 1/150 от OIEISS или предварителният разтвор от 1/2 от OIEELISAWPSS, или предварителният разтвор от 1/16 от OIEELISASPSS, реализиран в отрицателен серум (или в смес от отрицателни серуми) и разреден отново в отрицателни серуми в съотношение, равно на броя на пробите, съставляващи сместа, трябва да доведе до положителна реакция; б) OIEELISANSS трябва да води винаги до отрицателна реакция; в) тестът трябва да позволява да се открие наличието на инфекция в отделно животно или в група от животни, чиито серумни проби съставляват сместа. 2.2.2.3. Стандартизация на тестоватапроцедураза проби от мляко или суроватка под формата на смеси: а) предварителният разтвор от 1/1000 от OIEISS или предварителният разтвор от 1/16 от OIEELISAWPSS, или предварителният разтвор от 1/125 от OIEELISASPSS, реализиран в отрицателен серум (или в смес от отрицателни серуми) и разреден отново в отрицателно мляко от 1/10, трябва да доведе до положителна реакция; б) OIEELISANSS, разреден в отрицателно мляко от 1/10, трябва винаги да води до отрицателна реакция; (1) За целите на това приложение разтворите, посочени за изготвяне на течни реагенти, са изразени например като 1/150, което означава разтвор от 1 на 150. в) тестът трябва да позволява да се открие наличието на инфекция в отделно животно или в група от животни, чиито проби от мляко или суроватка съставляват сместа. 2.2.3. Условия за използване на ЕЛАЙЗА за диагностициране на бруцелоза по говедата 2.2.3.1. Ако се използват условията за калибриране за тестовете ЕЛАЙЗА, посочени в подточки 2.2.2.1 и 2.2.2.2, относно серумни проби, диагностичната чувствителност на ЕЛАЙЗА следва да е равна или по-висока от тази на RBT или CFT, като се вземе предвид епидемиологичната ситуация, при която се използват тестовете. 2.2.3.2. Ако се използват условията за калибриране за тестовете ЕЛАЙЗА, посочени в подточка 2.2.2.3, за смесени млечни проби, диагностичната чувствителност на ЕЛАЙЗА трябва да е равна или по-голяма от тази на MRT, като се вземе предвид не само епидемиологичната ситуация, но и средният и очакваният голям брой на животните в животновъдните системи. 2.2.3.3. В случаите, когато тестовете ЕЛАЙЗА се използват за целите на сертифицирането в съответствие с член 6, параграф 1 или за установяване и поддържане на статута на стадо в съответствие с приложение А, раздел II, точка 10, смесването на серумни проби трябва да се извърши по такъв начин, че резултатите от теста да могат да бъдат недвусмислено свързани с отделните животни, включени в сместа. Всеки тест за потвърждение трябва да бъде проведен с проби, взети от отделни животни. 2.2.3.4. Методът ЕЛАЙЗА може да бъде използван върху проби от мляко, взети от събраното мляко от ферма с най-малко 30% млечни крави в процес на лактация. Ако се използва този метод, трябва да бъдат взети мерки, за да се гарантира, че взетите за изследване проби могат да бъдат недвусмислено свързани с отделните животни, чието мляко се изследва. Всеки тест за потвърждение трябва да бъде проведен с проби, взети от отделни животни. 2.3. Изследване чрез реакция свързване на комплемента (CFT) 2.3.1. Антигенът представлява бактериална суспензия във фенолизиран физиологичен разтвор (NaCl 0,85% (m/v) и фенол 0,5% (v/v) или във вероналов буфер. Антигените може да се доставят в концентрирано състояние, при условие че факторът, който трябва да се използва за разтвора, е посочен на етикета на ампулата. Антигените трябва да се съхраняват при 4°C и да не бъдат замразявани. 2.3.2. Серумите трябва да бъдат инактивирани, както следва:

• говежди серум: 56 - 60°C за 30 - 50 минути;
• свински серум: 60°C за 30 - 50 минути.

2.3.3. За да се получи задоволителна реакция при провеждането на теста, се използва допълнителна доза, по-висока от минималната, необходима за цялостна хемолиза. 2.3.4. Следните проверки трябва да бъдат правени всеки път при провеждането на изследването чрез реакция свързване на комплемента (CFT): а) контрол на антикомплементния ефект на серума; б) контрол на антигена; в) контрол на чувствителните червени кръвни телца; г) контрол на комплемента; д) контрол чрез използване на положителен серум за чувствителност при започването на реакцията; е) контрол на специфичността на реакцията чрез използване на отрицателен серум. 2.3.5. Изчисляване на резултатите OIEISS съдържа 1000 международни единици CFT (ICFTU) на милилитър. Ако серумът OIEISS е тестван по даден метод, резултатът се дава като титър (т.е. най-високият директен разтвор на OIEISS, предизвикващ хемолиза от 50%, TOIEISS). Резултатът от изследването за тестовия серум, даден като титър (TTESTSERUM), трябва да бъде изразен в ICFTU на милилитър. За да се конвертира изражението на даден титър в ICFTU, факторът (F), необходим за конвертиране в ICFTU на титър от неизвестен тестов серум (TTESTSERUM), изпитан чрез този метод, може да бъде изчислен по формулата: F = 1000 1/TOIEISS. Съдържанието на международните единици CFT на милилитър тестов серум (ICFTUTESTSERUM) може да бъде изчислено по формулата: ICFTUTESTSERUM = F x TTESTSERUM. 2.3.6. Интерпретиране на резултатите Серум, съдържащ 20 или повече ICFTU на милилитър, се счита за положителен. 2.4. Млечен ринг тест (MRT) 2.4.1. Антигенът представлява бактериална суспензия във фенолизиран физиологичен разтвор (NaCl 0,85% (m/v) и фенол 0,5% (v/v), оцветена с хематоксилин. Антигенът трябва да се съхранява при 4°C и да не бъде замразяван. 2.4.2. Чувствителността на антигена трябва да бъде стандартизирана по отношение на OIEISS по такъв начин, че антигенът да произведе положителна реакция при разтвор от 1/500 от OIEISS в отрицателно мляко, а разтворът от 1/1000 трябва да бъде отрицателен. 2.4.3. Ринг тестът трябва да бъде правен върху проби от съдържанието на всеки бидон мляко или върху съдържанието на всяка цистерна за мляко от фермата. 2.4.4. Пробите от мляко не трябва да са били замразявани, затопляни или разклащани силно. 2.4.5. Реакцията трябва да се извърши, като се използва един от следните методи:

• върху колона от мляко, висока най-малко 25 mm, и върху обем мляко от 1 ml, към което са били добавени 0,03 ml или 0,05 ml от един от стандартизираните оцветени антигени;
• върху колона от мляко, висока най-малко 25 mm, и върху обем мляко от 2 ml, към което са били добавени 0,05 ml от един от стандартизираните оцветени антигени;
• върху обем мляко от 8 ml, към което са били добавени 0,08 ml от един от стандартизираните оцветени антигени.

2.4.6. Сместа на мляко и антигени трябва да бъде инкубирана при 37°C за 60 минути едновременно с положителни и отрицателни работни стандарти. Чувствителността на теста се подобрява, ако инкубацията бъде продължена при 4°C за период от 16 до 24 часа. 2.4.7. Интерпретиране на резултатите: а) отрицателна реакция: оцветено мляко, безцветна сметана; б) положителна реакция:

• идентично оцветени мляко и сметана, или
• безцветно мляко и оцветена сметана.

2.5. Тест с буфериран бруцелозен антиген (роз бенгал тест (RBT) 2.5.1. Антигенът представлява бактериална суспензия в разтвор от буфериран бруцелозен антиген при pH от 3,65 ± 0,05, оцветена с боя роз бенгал. Антигенът се доставя готов за използване и трябва да се съхранява при 4°C и да не бъде замразяван. 2.5.2. Антигенът се приготвя, без да се посочва клетъчната концентрация, но неговата чувствителност трябва да бъде стандартизирана по отношение на OIEISS по такъв начин, че антигенът да произведе положителна реакция при разтвор на серума от 1/45 и отрицателна реакция при разтвор от 1/55. 2.5.3. RBT се изпълнява по следния начин: а) серумът (20 - 30 l) се смесва с равен обем антиген върху бяла плочка или плочка от емайл, така че да се получи зона от около 2 cm в диаметър. Сместа се разклаща леко в продължение на четири минути на стайна температура и после се наблюдава под добро осветление за наличие на аглутинация; б) ако се използва автоматизиран метод, той трябва да бъде поне толкова чувствителен и прецизен, колкото ръчния метод. 2.5.4. Интерпретиране на резултатите Всяка видима реакция се смята за положителна, освен ако по ръбовете се наблюдава прекомерно засъхване. Във всяка серия тестове трябва да бъдат включени положителни и отрицателни работни стандарти. 2.6. Изследване чрез серумна реакция аглутинация (SAT) 2.6.1. Антигенът представлява бактериална суспензия във фенолизиран физиологичен разтвор (NaCl 0,85% (m/v) и фенол 0,5% (v/v). Не трябва да се използва формалдехид. Антигените могат да се доставят в концентрирано състояние, при условие че факторът, който трябва да се използва за разтвора, е посочен на етикета на ампулата. Към суспензията от антиген може да се добави етилендиаминтетраацетат (ЕДТА) до получаването на окончателен тестов разтвор от 5 mM, за да се намали нивото на фалшиви положителни реакции при серумаглутинационния тест. Впоследствие pH от 7,2 трябва да се коригира в суспензията от антиген. 2.6.2. OIEISS съдържа 1000 международни единици аглутинация. 2.6.3. Антигенът се приготвя, без да се посочва клетъчната концентрация, но неговата чувствителност трябва да бъде стандартизирана по отношение на OIEISS по такъв начин, че антигенът да произведе 50% аглутинация при окончателен разтвор на серума между 1/600 и 1/1000 или 75% аглутинация при окончателен разтвор на серума между 1/500 и 1/750. Също така може да бъде полезно да се сравни реактивността на нови и стандартизирани преди това партиди от антигени, като се използва набор от дефинирани серуми. 2.6.4. Тестът се провежда в епруветки или в микроплаки. Сместа от антиген и разтвори от серуми се инкубира при 37°C за 16 - 24 часа. Приготвят се най-малко три разтвора за всеки серум. Разтворите на съмнителен серум трябва да бъдат правени по такъв начин, че отчитането на реакцията в границата на положителност да се прави в средната епруветка (или в средната клетка при метода на микроплаките). 2.6.5. Интерпретиране на резултатите Степента на бруцелозна аглутинация в серум трябва да бъде изразена в международни единици аглутинация (IU) на милилитър. Серум, съдържащ 30 или повече IU на ml, се счита за положителен. 2.7. Флуоресцентно-поляризационен тест (FPA) 2.7.1. FPA може да бъде проведен в стъклени епруветки или в микроплаки с 96 клетки. Използваните техники, тяхната стандартизация и интерпретирането на резултатите трябва да отговарят на определеното в Наръчника по диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, шесто издание, 2008 г., глава 2.4.3 (бруцелоза по говедата). 2.7.2. Стандартизация на теста FPA се стандартизира така, че: а) OIEELISASPSS и OIEELISAWPSS да дават систематично положителни резултати; б) предварителният разтвор от 1/8 от OIEELISAWPSS или предварителният разтвор от 1/64 от OIEELISASPSS, реализиран в отрицателен серум (или в смес от отрицателни серуми), да води винаги до отрицателна реакция; в) OIEELISANSS да води винаги до отрицателна реакция. Във всяка партида тестове трябва да бъдат включени: силноположителен, слабоположителен, отрицателен серум работен стандарт (калибрирани спрямо стандартните серуми ЕЛАЙЗА на OIE).

1. ДОПЪЛНИТЕЛНИ ТЕСТОВЕ

3.1. Кожен тест за бруцелоза (BST) 3.1.1. Условия за използването на BST a) Кожният тест за бруцелоза не се използва за целите на сертифицирането за търговия в рамките на Общността. б) Кожният тест за бруцелоза е един от най-специфичните тестове за откриване на бруцелоза при неваксинирани животни; при все това не бива да се прави диагноза въз основа само на положителни интрадермални реакции. в) Говеда, тествани с отрицателен резултат при един от серологичните тестове, определени в това приложение и реагиращи положително на BST, се считат за инфектирани или със съмнение за инфекция. г) Говеда, тествани с положителен резултат при един от серологичните тестове, определени в това приложение, могат да бъдат подложени на BST, за да се потвърди интерпретирането на резултатите от серологичните тестове, особено в случаите, когато не може да се изключи кръстосана реакция между антитела и други бактерии в официално свободно или в свободно от бруцелоза стадо говеда. 3.1.2. Тестът трябва да се проведе, като се използва стандартизиран и дефиниран бруцелозен алергенен препарат, който не съдържа антиген на гладки липополизахариди (LPS), тъй като това може да предизвика неспецифични възпалителни реакции или да повлияе на по-нататъшните серологични тестове. Изискванията за производство на бруцелин трябва да съответстват на посочените в глава 2.4.3, раздел С, точка 1 от Наръчника по диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, шесто издание, 2008 г. 3.1.3. Процедура на теста 3.1.3.1. 0,1 ml бруцелозен алерген се инжектира интрадермално в опашната гънка, в кожата на хълбока или в една от страните на шията. 3.1.3.2. Тестът се отчита след 48 - 72 часа. 3.1.3.3. Дебелината на кожата на мястото на инжекцията се измерва с шублер преди инжектиране и при повторния преглед. 3.1.3.4. Интерпретиране на резултатите Силната реакция се забелязва лесно по подуването и втвърдяването на съответното място. Удебеляване на кожата от 1,5 до 2 mm се смята за положителна реакция на BST. 3.2. Конкурентен имуноензимен метод (кЕЛАЙЗА) 3.2.1. Условия за използването на кЕЛАЙЗА кЕЛАЙЗА не се използва за целите на сертифицирането за търговия в рамките на Общността. Говеда, тествани с положителен резултат при един от другите серологични тестове, определени в това приложение, могат да бъдат подложени на кЕЛАЙЗА, за да се потвърди интерпретирането на резултатите от другите серологични тестове, особено в случаите, когато не може да се изключи кръстосана реакция между антитела и други бактерии в официално свободно или в свободно от бруцелоза стадо говеда или за да се елиминират реакции, дължащи се на остатъчни антитела, свързани с ваксинация с ваксина S19. 3.2.2. Процедура на теста Тестът се изпълнява в съответствие с глава 2.4.3, раздел В, точка 2 от Наръчника по диагностични тестове и ваксини за сухоземни животни на OIE, шесто издание, 2008 г.

1. НАЦИОНАЛНА РЕФЕРЕНТНА ЛАБОРАТОРИЯ

4.1. Задачи и отговорности Националната референтна лаборатория, определена в съответствие с член 10, отговаря за: а) одобрението на резултатите от валидираните проучвания, които показват достоверността на използваните методи в Р България; б) определянето на максимален брой проби, които се вземат при използването на изследвания чрез ЕЛАЙЗА метод; в) калибриране на вторичните референтни национални серумни стандарти ("работни стандарти") спрямо първоначалните международни стандарти, посочени в т. 2.1; д) качествени проверки на всички антигени и групи ЕЛАЙЗА методи, които се използват в държавите членки; е) съвместно сътрудничество с националните референтни лаборатории за бруцелоза на държавите членки.

Приложение № 4 къмчл. 40 ИЗСЛЕДВАНИЯ ЗА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА Тестове за ензоотична левкоза по говедата се извършват чрез агар гел имунно-дифузионен тест (AGID) при условията, описани в раздели A и Б, или чрез ензимосвързан имуносорбентен анализ (ELISA) при условията, описани в раздел В. Агар гел имунно-дифузионният метод може да бъде използван само за изследване на отделни проби. Ако резултатите от теста бъдат оспорени, като бъдат надлежно представени доказателства, се прави допълнителна проверка посредством агар гел имунно-дифузионен тест. AGID и ELISA се стандартизират спрямо E05 серум, който е официалният стандартен серум на ЕС и се доставя от: Friedrich-Loeffler-Institut Federal Research Institute for Animal Health Референтна лаборатория на OIE за ензоотична левкоза по говедата (ЕЛГ) Sudufer 10, 17493 Greifswald - Insel Riems, Германия А. АГАР ГЕЛ ИМУННО-ДИФУЗИОНЕН ТЕСТ ЗА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА

1. Антигенът, който следва да бъде използван в теста, трябва да съдържа гликопротеин на левкозен вирус по говедата. Антигенът е стандартизиран спрямо E05 серум.
2. Националната референтна лаборатория, определена в съответствие счлен 10за координиране на стандартите и методите за диагностициране на тестовете за ензоотична левкоза по говедата, следва да отговаря за калибрирането на стандартните работни антигени на лабораторията спрямо официалния ЕО стандартен серум (EI серум), осигурен от Националния ветеринарен институт към Техническия университет на Дания.
3. Стандартните антигени, използвани в лабораторията, следва да бъдат предавани най-малко веднъж годишно на други лаборатории, в които се извършват изследвания за ЕЛГ, за тестване спрямо официалния ЕО стандартен серум. Освен чрез това стандартизиране използваният антиген може да се калибрира в съответствие с метода, описан в буква Б.
4. Реагентите за теста се състоят от:

а) антиген: антиген, който трябва да съдържа специфичен гликопротеин от вируса на ензоотична левкоза по говедата, стандартизиран спрямо E05 серум; б) тест серума; в) известен положителен контролен серум; г) агар гел:

• 0,8% агар;
• 8,5% NaCl;
• трис буферен разтвор, моларност 0,05 М, рН 7,2;
• 15 ml от този агар трябва да се сложат в петриева паничка с диаметър 85 mm, като в резултат се получава 2,6 mm дълбок агарен слой.

1. В агарния слой до дъното на паничката трябва да се изреже тест форма, състояща се от седем свободни от влага ямки; формата трябва да се състои от една централна ямка и шест ямки в кръг около нея.

Диаметър на централна ямка: 4 mm. Диаметър на периферните ямки: 6 mm. Разстояние между централната и периферните ямки: 3 mm.

1. Централната ямка трябва да бъде напълнена със стандартния антиген. Периферните ямки с номера 1 и 4, посочени в раздел Б.3, се запълват с известния положителен серум; ямки 2, 3, 5 и 6 се запълват с тест серумите. Ямките се запълват до изчезване на мениска.
2. Това води до получаване на следните количества:

• антиген: 32 µl;
• контролен серум: 73 µl;
• тест серум: 73 µl.

1. Инкубирането трябва да е с продължителност 72 часа при стайна температура (между 20 и 27°C) в затворена влажна камера.
2. Тестът може да се отчете на 24 и 48 часа, но окончателният резултат не може да бъде получен по-рано от 72 часа:

а) даден тест серум е положителен, ако той образува специфична утаечна линия с антигена на вируса на левкозата по говедата (ЕЛГ) и образува непрекъсната идентична линия с контролния серум; б) даден тест серум е отрицателен, ако той не образува специфична утаечна линия с антигена на ЕЛГ и не изкривява линията на контролния серум; в) реакцията не би могла да се разглежда като определяща, ако тя: i) отчетливо изкривява линията на контролния серум в посока на антигена на вируса на ЕЛГ, без при това да формира видима утаечна линия с антигена; или ii) не може да бъде отчетена нито като положителна, нито като отрицателна. При неопределените реакции тестовете могат да бъдат повторени и да се използва концентриран серум.

1. Може да се използва каквато и да е друга конфигурация или схема на разпределение, при условие че позволява като положителен да се отчете серум E05, разреден в съотношение 1:10 в отрицателен серум.

Б. МЕТОД ЗА СТАНДАРТИЗИРАНЕ НА АНТИГЕН

1. Необходими разтвори и материали:

а) 40 ml от 1,6% агароза в буферен разтвор трис/HCl, моларност 0,05 M, pH 7,2 с 8,5% NaCl; б) 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ антитяло само към гликопротеини на вируса на левкозата по говедата, разреден в съотношение 1:10 в буферен разтвор трис/HCl, моларност 0,05 M, pH 7,2 с 8,5% NaCl; в) 15 ml от серум от левкоза по говедата, съдържащ антитяло само към гликопротеини на вируса на левкозата по говедата, разреден в съотношение 1:5 в буферен разтвор трис/HCl, моларност 0,05 M, pH 7,2 с 8,5% NaCl; г) четири пластмасови петриеви панички с диаметър 85 mm; д) пробивно острие с диаметър между 4 и 6 mm; е) референтен антиген; ж) антиген, който подлежи на стандартизиране; з) водна баня (56°C).

1. Процедура:

Разтваря се агарозата (1,6%) в буферния разтвор трис/HCl, като внимателно се загрява до 100°C. Поставя се във водна баня при 56°C за около един час. Разтворите на серума на левкозата по говедата също трябва да се поставят във водна баня при 56°C. Разбъркват се 15 ml от загретия на 56°C агарозен разтвор с 15 ml серум от левкоза по говедата (1:10), бързо се разклащат и се изливат в обем от по 15 ml във всяка една от двете петриеви панички. Процедурата се повтаря и със серума от левкоза по говедата, разреден в съотношение 1:5. Когато агарозата се е втвърдила, в нея се правят дупки, както следва: Петриева паничка № 1 Серум 1:10 Петриева паничка № 2 Серум 1:10 Петриева паничка № 3 Серум 1:5 Петриева паничка № 4 Серум 1:5

1. Добавяне на антиген:

а) петриеви панички 1 и 3: i) ямка A - неразреден референтен антиген; ii) ямка B - разреден в съотношение 1:2 референтен антиген; iii) ямки С и Е - референтен антиген; iv) ямка D - неразреден тест антиген; б) петриеви панички 2 и 4: i) ямка A - неразреден тест антиген; ii) ямка B - разреден в съотношение 1:2 тест антиген; iii) ямка C - разреден в съотношение 1:4 тест антиген; iv) ямка D - разреден в съотношение 1:8 тест антиген.

1. Допълнителни инструкции:

а) за да може да се получи оптимално утаяване, експериментът трябва да се осъществи с два серумни разтвора (разредени в съотношение 1:5 и 1:10); б) ако диаметърът на утайката е прекалено малък и при двата разтвора, серумът трябва да бъде разреден допълнително; в) ако диаметърът на утайката при двата разтвора е прекалено голям и слаб, трябва да се избере серум с по-ниска степен на разреждане; г) крайната концентрация на агарозата трябва да бъде 0,8%; тази на серумите - съответно 5% и 10%; д) отбелязват се измерените диаметри в следната координатна система: работният титър на тествания антиген представлява неговия разтвор, при който се получава диаметър, равен на получения с референтния антиген. Диаметър (в mm) Разтвори на антигени В. ЕНЗИМОСВЪРЗАН ИМУНОСОРБЕНТЕН АНАЛИТИЧЕН ТЕСТ (ELISA) ЗА ОТКРИВАНЕ НА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА

1. Материалите и реагентите, които се използват, са следните:

а) твърдофазови микроплаки, епруветки или други в твърда фаза; б) антигенът е фиксиран към твърдата фаза със или без помощта на поликлонални или моноклонални улавящи антитела; ако антигенът е директно приложен към твърдата фаза, всички тест проби, даващи положителни реакции, трябва да бъдат тествани отново към контролния антиген; контролният антиген следва да бъде идентичен с антигена с тази разлика, че отсъстват BLV антигени; ако улавящите антитела са приложени към твърдата фаза, антителата не трябва да реагират на антигени, различни от BLV антигени; в) биологична течност, която трябва да се тества; г) съответстващ положителен и отрицателен контрол; д) конюнгат; е) субстрат, адаптиран към използвания ензим; ж) спиращ разтвор, ако е необходим; з) разтвори за разреждането на тест проби за препарати на реагенти и за измиване; и) подходяща за използвания субстрат система за отчитане.

1. СТАНДАРТИЗИРАНЕ И ЧУВСТВИТЕЛНОСТ НА ТЕСТА

Чувствителността на теста ELISA трябва да е от такъв порядък, че да може да отчете положителен резултат от E05 серум, когато той е разреден 10 пъти повече (серумни проби) или 250 пъти повече (млечни проби) от разтвора, получен от отделните проби, ако те са включени в групи. При анализи, при които се изследват отделни проби (серумни и млечни), E05 серумът, разреден в съотношение 1:10 (при отрицателен серум) или в съотношение 1:250 (при отрицателно мляко), трябва да отчете положителен резултат, когато е изследван при същата степен на разреждане като отделните тест проби. Лабораторията по чл. 10 отговаря за проверката на качеството на ELISA метода, и по-специално за определянето на броя на пробите за всяка производствена партида, които следва да се обединят в обща група въз основа на изброената стойност, получена за E05 серума.

1. УСЛОВИЯ ЗА ИЗПОЛЗВАНЕ НА ELISA ТЕСТА ЗА ЕНЗООТИЧНА ЛЕВКОЗА ПО ГОВЕДАТА

а) тестовете ELISA могат да бъдат използвани върху серумни и млечни проби; б) в случаите, в които тестовете ELISA се използват за целите на сертифицирането в съответствие с член 6, параграф 2, буква в) или за установяване и поддържане на статус на стадо в съответствие с приложение Г, раздел I, групирането на серумни или млечни проби трябва да се извърши по такъв начин, че взетите за изследване проби да могат да се отнесат по недвусмислен начин до отделните животни в групата; всеки тест за потвърждение трябва да бъде извършен с проби, взети от отделни животни; в) когато тестовете ELISA се прилагат върху проба от мляко от различни животни, тази проба се взима от мляко, събрано от стадо, в което най-малко 30% от млечните крави са в период на лактация; всеки тест за потвърждение се извършва със серумни или млечни проби, взети от отделни животни.

Приложение № 5 къмчл. 12, ал. 1

Приложение № 6 къмчл. 12, ал. 2 Болести, за които се изискват допълнителни гаранции: Ауески Заразен ринотрахеит по говедата Бруцелоза по свинете Трансмисивен гастроентерит