Чл. 27

Чл. 27.(В сила от 01.01.2007 г., изм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) Българската агенция по безопасност на храните след ликвидиране на възникналите епизоотични огнища от НБП изпраща информация до Европейската комисия за разходите, направени при унищожаването на болни и контактни птици.

Допълнителни разпоредби § 1. По смисъла на тази наредба:

1. "Птицевъден обект" е всяко място, ферма, двор, комплекс в страната, където се отглеждат или настаняват птици.
2. (изм. - ДВ, бр. 76 от 2006 г.) "Птици" са кокошки, пуйки, токачки, пауни, яребици, пъдпъдъци, патици, гъски, гълъби, фазани, кеклици, щраусовидни видове, отглеждани в затворени помещения.
3. "Нюкасълска болест по птиците" е силно контагиозно заболяване по домашните и дивите видове птици, причинявано от вирус, принадлежащ към семейство "Парамиксовириде", серотип 1, при условие че този серотип показва интрацеребрален патогенен индекс при еднодневни пилета, по-голям от 0,7.
4. "Интрацеребрален патогенен индекс" е показател, определящ невропатогенността на даден изолат на вируса на НБП. Представлява цифров израз на патогенността, изчислена въз основа на здравословното състояние на 10 еднодневни пилета, инокулирани интрацеребрално и наблюдавани в продължение на 8 дни (по стандарт).
5. "Състезателни гълъби" са гълъби, отглеждани в затворени помещения, които излитат периодично, връщат се на същото място или отиват на друго място за отглеждане на състезателни гълъби.
6. "Място за отглеждане на гълъби" е съоръжение за отглеждане и развъждане на състезателни гълъби.
7. "Заразени птици" са птици, при които е поставена лабораторно диагноза НБП или в случай на вторично възникване на заболяването то е потвърдено въз основа на клинични признаци или патологоанатомични изменения.
8. "Птици, съмнителни за заболяване" са птици, които показват клинични признаци или патологични изменения, наподобяващи НБП.
9. "Птици, съмнителни за заразяване" са птици, за които има данни за пряк или непряк контакт с вируса на НБП.
10. "Кухненски отпадъци" са отпадъци от кухни, столове, ресторанти и предприятия, преработващи месо.
11. (изм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) "Стемпинг-аут" - провеждане под ръководството на БАБХ на редица мероприятия, като унищожаване на болните и заразените животни в стадото, а в случай на необходимост - и на животните от други стада, които са имали пряк или непряк контакт с животните от заразеното стадо, водещ до предаване на заразния причинител. Стемпинг-аут се придружава от почистване и дезинфекция на помещенията.
12. (изм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) "Компетентни власти" - БАБХ е официалната компетентна служба за управление, осъществяване и контрол на ветеринарномедицинската дейност.
13. "Велогенна форма на Нюкасълската болест" - силно патогенна форма на болестта.
14. "Мезогенна форма на Нюкасълската болест" - средно патогенна форма на болестта.
15. "Волиерни птици" - диви птици, отглеждани във ферми.
16. "Контаминиране" - замърсяване с микроорганизми.
17. "Атенуиран" - отслабен по патогенност щам на вируса.
18. "Контагиозно заболяване" - заразно заболяване.
19. "Инокулиране" - заразяване на птичи ембриони с патогенни микроорганизми.
20. "Хламидии" - вид микроорганизми.
21. "Супернатантен" - надстоящата течност над получената в резултат на центрофугиране утайка.
22. "Алантоисна течност" - ембрионална течност в кокошия зародиш.
23. "Хемаглутинация" - слепване и утаяване на еритроцитите помежду им в диагностична реакция.
24. "Имуносорбентен" - имунологична реакция, която се извършва върху твърда фаза (на повърхността на полистиролна плака или епруветка).
25. "Микротитърна" - количествено определяне с микрообеми.
26. "Изотонично" - концентрация на солите, изравнена с органичната течност.
27. "Аглутинация" - струпване на малки купчинки и утаяване на бактерии, еритроцити и други клетъчни елементи.
28. (нова - ДВ, бр. 76 от 2006 г.) "Предпазна зона" - зона с радиус най-малко 3 km около огнището, в която се прилагат ограничителни мерки по отношение на придвижване на животни, продукти от тях, превозни средства и хора.
29. (нова - ДВ, бр. 76 от 2006 г., изм. - ДВ, бр. 64 от 2008 г.) "Наблюдавана зона" е зона с минимален радиус 10 km, започващ от центъра на епизоотичното огнище, и включва всички птицевъдни обекти на територията си, както и птицевъдните обекти на предпазната зона.
30. (нова - ДВ, бр. 64 от 2008 г., изм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) "Официален ветеринарен лекар" - ветеринарен лекар от БАБХ почл. 9 ЗВД.

§ 1а. (Нов - ДВ, бр. 8 от 2010 г., в сила от 29.01.2010 г., доп. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) Тази наредба въвежда изискванията начл. 16 от Директива 2008/73/ЕОна Съвета от 15 юли 2008 г. за опростяване на процедурите по вписване и публикуване на информация във ветеринарната и зоотехническата област и за изменение на директиви 64/432/ЕИО, 77/504/ЕИО, 88/407/ЕИО, 88/661/ЕИО, 89/361/ЕИО, 89/556/ЕИО, 90/426/ЕИО, 90/427/ЕИО, 90/428/ЕИО, 90/429/ЕИО, 90/539/ЕИО, 91/68/ЕИО, 91/496/ЕИО, 92/35/ЕИО, 92/65/ЕИО, 92/66/ЕИО, 92/119/ЕИО, 94/28/EO, 2000/75/EO, Решение 2000/258/ЕО и директиви 2001/89/EO, 2002/60/ЕО и 2005/94/EO (обнародвана в OВ, бр. L219 от 2008 г.) и изискванията наДиректива (ЕС) 2018/597на Европейския парламент и на Съвета от 18 април 2018 г. за изменение на Директива 92/66/ЕИО на Съвета за въвеждането на мерки на Общността за борба с Нюкясълската болест (ОВ L 103, 23.04.2018 г.).

Заключителни разпоредби § 2. Наредбата се издава на основаниечл. 47, ал. 3 от Закона за ветеринарномедицинската дейност.

§ 3. Тази наредба отменяНаредба № 28 от 2001 г. за профилактика и борба с Нюкасълската болест (псевдочума) по птиците(ДВ, бр. 67 от 2001 г.).

§ 4. (Изм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) Изпълнението на наредбата се възлага на изпълнителния директор на БАБХ.

§ 5. Наредбата влиза в сила от 1.V.2006 г., с изключение начл. 27и т. 4 отприложение № 4 към чл. 22, които влизат в сила от 1.I.2007 г.

Заключителни разпоредбиКЪМ НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 31 ОТ 2005 Г. ЗА МЕРКИТЕ ЗА ПРОФИЛАКТИКА, ОГРАНИЧАВАНЕ И ЛИКВИДИРАНЕ НА НЮКЯСЪЛСКАТА БОЛЕСТ (ПСЕВДОЧУМА) ПО ПТИЦИТЕ И ЗА УСЛОВИЯТА И РЕДА ЗА ПРИЛАГАНЕТО ИМ (ОБН. - ДВ, БР. 76 ОТ 2006 Г.) § 7. Разпоредбата по т. 4 отприложение № 4 към чл. 22влиза в сила от 1 януари 2007 г.

НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 31 ОТ 2005 Г. ЗА МЕРКИТЕ ЗА ПРОФИЛАКТИКА, ОГРАНИЧАВАНЕ И ЛИКВИДИРАНЕ НА НЮКЯСЪЛСКАТА БОЛЕСТ (ПСЕВДОЧУМА) ПО ПТИЦИТЕ И ЗА УСЛОВИЯТА И РЕДА ЗА ПРИЛАГАНЕТО ИМ Допълнителни разпоредбиКЪМ НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 31 ОТ 2005 Г. ЗА МЕРКИТЕ ЗА ПРОФИЛАКТИКА, ОГРАНИЧАВАНЕ И ЛИКВИДИРАНЕ НА НЮКЯСЪЛСКАТА БОЛЕСТ (ПСЕВДОЧУМА) ПО ПТИЦИТЕ И ЗА УСЛОВИЯТА И РЕДА ЗА ПРИЛАГАНЕТО ИМ (ОБН. - ДВ, БР. 64 ОТ 2008 Г.) § 16. Снаредбатасе въвеждаДиректива на Съвета 92/66/ЕЕСза контрол на псевдочумата по птиците (OB L 260, 5.9.1992 г., стр. 1 - 20).

Заключителни разпоредбиКЪМ НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 31 ОТ 2005 Г. ЗА МЕРКИТЕ ЗА ПРОФИЛАКТИКА, ОГРАНИЧАВАНЕ И ЛИКВИДИРАНЕ НА НЮКЯСЪЛСКАТА БОЛЕСТ (ПСЕВДОЧУМА) ПО ПТИЦИТЕ И ЗА УСЛОВИЯТА И РЕДА ЗА ПРИЛАГАНЕТО ИМ (ОБН. - ДВ, БР. 8 ОТ 2010 Г., В СИЛА ОТ 29.01.2010 Г.) § 5.Наредбатавлиза в сила от деня на обнародването и в "Държавен вестник".

НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 31 ОТ 2005 Г. ЗА МЕРКИТЕ ЗА ПРОФИЛАКТИКА, ОГРАНИЧАВАНЕ И ЛИКВИДИРАНЕ НА НЮКЯСЪЛСКАТА БОЛЕСТ (ПСЕВДОЧУМА) ПО ПТИЦИТЕ И ЗА УСЛОВИЯТА И РЕДА ЗА ПРИЛАГАНЕТО ИМ Преходни и Заключителни разпоредбиКЪМ НАРЕДБА ЗА ИЗМЕНЕНИЕ И ДОПЪЛНЕНИЕ НА НАРЕДБА № 31 ОТ 2005 Г. ЗА МЕРКИТЕ ЗА ПРОФИЛАКТИКА, ОГРАНИЧАВАНЕ И ЛИКВИДИРАНЕ НА НЮКЯСЪЛСКАТА БОЛЕСТ (ПСЕВДОЧУМА) ПО ПТИЦИТЕ И ЗА УСЛОВИЯТА И РЕДА ЗА ПРИЛАГАНЕТО ИМ (ОБН. - ДВ, БР. 64 ОТ 2018 Г., В СИЛА ОТ 03.08.2018 Г.) § 21.Наредбатавлиза в сила от деня на обнародването и в "Държавен вестник", като§ 2,§ 6,§ 7, т. 2 и т. 3,§ 9, т. 2,§ 13,§ 15,§ 18,§ 19, т. 8и§ 20, т. 3, буква "в" и т. 5се прилагат от 1 януари 2019 г.

Приложение № 1 къмчл. 3, ал. 1 (Изм. - ДВ, бр. 64 от 2008 г., отм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 01.01.2019 г.)

Приложение № 2 къмчл. 8, ал. 2, т. 1, буква "в" (Изм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) Условия за придвижване на яйца от животновъден обект почл. 8 Българската агенция по безопасност на храните разрешава транспортирането на яйца от птицевъден обект, в който има съмнение за наличие на НБП, при условие че:

1. отговарят на изискванията по раздели II, III, IV и V на Наредба № 31 (ДВ, бр. 67 от 2001 г.);
2. бъдат изпратени директно от подозрителната ферма или обект към определено за целта от БАБХ преработвателно предприятие, като всяка партида се запечатва преди изпращането и от ветеринарния лекар, отговорен за съответния птицевъден обект; партидата остава запечатана през цялото времетраене на транспортирането и до предприятието;
3. ветеринарният лекар, отговорен за подозрителния птицевъден обект, информира определеното предприятие за намерението си да изпрати партида яйца;
4. ветеринарният лекар, отговорен за преработвателното предприятие, осигурява условия:

(а) посочените в т. 2 яйца да бъдат държани изолирани от останалите яйца от момента на пристигането им до тяхната преработка; (б) черупките от такива яйца да бъдат считани за високо рисков материал; (в) опаковъчният материал, превозните средства, използвани за транспортиране на яйцата по т. 2, както и всички помещения, с които такива яйца са били в контакт, са почистени и дезинфекцирани по такъв начин, че да се гарантира унищожаването на вируса на Нюкасълската болест; (г) отговорният за подозрителния птицевъден обект официален ветеринарен лекар да бъде информиран за всички пратки с преработени яйца.

Приложение № 3 къмчл. 14, ал. 3 (Изм. - ДВ, бр. 64 от 2008 г., предишно Приложение № 3 към чл. 20 и чл. 9, ал. 1, т. 3 - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) Правила за дезинфекция при Нюкасълска болест по птиците Дезинфекция на птицевъдни обекти, засегнати от НБП, в които всички птици са унищожени

1. Предварително почистване и дезинфекция

В свободните от птици сгради се извършва механично почистване. Почистват се всички помещения, в които птиците са били настанени, всички сгради, дворове и др., замърсени по време на клане или по време на следкланичния преглед. Използваните дезинфектанти престояват върху почистваните повърхности минимум 24 часа. Всички тъкани от птици или яйца, които биха могли да контаминират сградите, дворовете, съдовете, внимателно се събират и унищожават.

1. (изм. - ДВ, бр. 64 от 2008 г.) Заключително почистване и дезинфекция

Прахта и мазнините се премахват от всички повърхности чрез прилагане на детергенти и измиване с вода, след което всички повърхности се напръскват с дезифектант. След 7-дневен период помещенията се третират отново с обезмасляващ агент, измиват се със студена вода, напръскват се с дезинфектант и отново се измиват с вода. Използваната торова постеля се обезврежда по начин, гарантиращ унищожаване на вируса. Обезвреждането може да се извърши по следните начини:

• чрез изнасяне от помещенията и загробване на най-малко 100 м; при загробването торовата постеля се размесва с негасена вар в съотношение 100 кг негасена вар към 1 м3торова постеля; дълбочината на загробване е такава, че да се предотврати достъпът на гризачи и диви птици;
• чрез натрупването и на купчина и покриване, така че да се постигне влажност и температура от 20°C за период от 42 дни, като се предотврати достъпът на гризачи и диви птици;
• друг начин за обезвреждане е чрез изгаряне или третиране с пара при температура 70°С.

Приложение № 4 къмчл. 21 (Изм. - ДВ, бр. 76 от 2006 г., предишно Приложение № 4 към чл. 22 - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 03.08.2018 г.) Диагностични процедури за потвърждаване и диференциална диагностика на Нюкасълска болест по птиците

1. Вземане и обработване на проби

а) Проби Клоакални тампон-проби (или фекалии) и трахеални тампон-проби от болни птици; фекалии или чревно съдържание, мозъчна тъкан, трахеи, бели дробове, черен дроб, далак и други очевидно засегнати органи от умрели неотдавна птици. б) Обработване на пробите Органите и тъканите, посочени в буква "а", се смесват, а фекалните проби се третират отделно. Тампоните се поставят в достатъчно количество антибиотична среда, като се осигурява пълното им потапяне в нея. Фекалните проби и органите се хомогенизират (в затворен хомогенизатор или с хаван, пестик и стерилен пясък) в антибиотична среда и се изготвя 10 - 20% суспензия в средата. Суспензиите се оставят в продължение на около два часа при стайна температура (или за по-дълго време при температура 4°С), като след това се очистват чрез центрофугиране (800 до 1000 g в продължение на 10 мин.). в) Антибиотична среда За фекалните проби се изискват високи концентрации на антибиотици, като типичната смес е 10 000 UI/мл пеницилин, 10 мг/мл стрептомицин, 0,25 мг/мл гентамицин и 5000 UI/мл микостатин във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Тези нива могат да се намалят до 5 пъти за тъкани и трахеални тампони. За премахване на хламидии може да се добави 50 мг/мл окситетрациклин. Абсолютно задължително е след добавяне на антибиотиците да се проверява стойността на рН и да се коригира до стойности между 7,0 и 7,4.

1. Изолиране на вируса

а) Изолиране на вируса в кокоши ембриони Пречистената супернатантна течност се инокулира в количества по 0,1 - 0,2 мл в алантоисната кухина на всяко едно от най-малко 4 кокоши ембриона, които са били инкубирани 8 - 10 дни. Най-добре е тези яйца да са получени от специфично, свободно от патогенни микроорганизми птиче стадо, но когато това е невъзможно, се използват яйца, получени от стадо, което е тествано за липса на антитела срещу вируса на Нюкасълската болест. Инокулираните яйца се държат при температура 37°С и ежедневно се овоскопират. Яйцата с мъртви или умиращи ембриони, както и всички останали яйца 6 дни след инокулирането се изстудяват при 4°С и алантоисно/амнионовите течности се тестват за наличие на хемаглутинираща активност. Ако не се установи наличие на хемаглутинация, описанатапроцедурасе повтаря, като за заразяване на ембрионите се използва неразредена алантоисно/амнионова течност. При установяване на хемаглутинация се изключва наличието на бактерии в културата. Ако присъстват бактерии, течностите могат да се прекарат през 450 nm мембранен филтър, да се добавят други антибиотици и да се инокулират в кокоши ембриони по описания начин.

1. (изм. - ДВ, бр. 76 от 2006 г.) Диференциална диагноза

Всички хемаглутиниращи агенти се изпращат на националната референтна лаборатория по чл. 22 за потвърждаване на резултатите и пълно идентифициране, характеризиране и тестове за патогенност, както и антигенно и биологично типизиране на вируса. Междувременно се прилагат всички мерки за ограничаване на възможността за разпространение на вируса. Регионалните лаборатории установяват наличието на вируса на Нюкясълската болест. Хемаглутиниращите течности се използват след това в реакцията за задържане на хемаглутинацията, описана в т. 6 и 7. Положителна хемаглутинация при разреждане 24 или повече, при използване на моноспецифичен антисерум срещу вируса на Нюкясълската болест, за който се знае, че е със стойност най-малко 29, следва да послужи като предварително идентифициране и се изисква налагането на всички контролни мерки за предпазване от разпространение на болестта.

1. (В сила от 01.01.2007 г., изм. - ДВ, бр. 76 от 2006 г., в сила от 01.01.2007 г.) Бързи тестове за откриване на вируса на Нюкясълска болест при ваксинирани птици и антитела при неваксинирани

Няколко бързи теста, които директно откриват антигени на Нюкясълската болест, се използват при диагностиката на заболяването при ваксинирани птици. Тези, които се прилагат най-често, са флуоресцентни тестове за доказване на антитела върху надлъжни разрези от трахеи и пероксидазни тестове за доказване на антитела върху мозъчна тъкан. За диагностика на заболяването могат да се използват и други тестове, които директно откриват антигени на Нюкясълската болест. Неудобството на подобни тестове е, че не е практично да се използват за откриване на вируса във всичките му потенциални области на репликация. Наличието или отсъствието на вируса в трахеята не изключва вирусна репликация в червата. Не се препоръчва рутинното използване на директните методи за диагностиката на Нюкясълската болест, въпреки че при определени обстоятелства тези методи могат да играят полезна роля.

1. Откриване на антитела при неваксинирани птици

а) Проби Кръвни проби се вземат от всички птици, когато числеността на птичите стада е под 20 глави, и от 20 птици - за по-големите стада (това би дало 99% вероятност за откриване на поне един положителен серум, ако 25% или по-висок процент от стадото е с положителен резултат, независимо от големината на стадото). Кръвта се оставя да се съсири и след това серумът се отделя за тестване. б) Изследване за наличие на антитела За откриването на антитела срещу вируса може да се използва методът ЕЛАЙЗА (ензимно свързан имуносорбентен анализ). Отделните серумни проби се тестват за способността им да възпират хемаглутиниращата активност на вируса на Нюкасълската болест при условията на стандартната реакция за задържане на хемаглутинацията, описана в т 7. Националната референтна лаборатория на България определя за работно разреждане на вируса да се използват 4 хемоглутинационни единици. При 4 хемоглутинационни единици (ХАЕ) за положителен следва да се приема всеки серум с титър, равен на 24или по-голям.

1. Реакция хемаглутинация

Реагенти

1. Изотоничен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (0,05 М) със стойност на рН между 7,0 и 7,4.
2. Еритроцити (RBC) - взети и събрани в обща проба от най-малко три свободни от патогенни микроорганизми кокошки (ако няма такива, кръвта се взима от птици, които са били обект на редовно наблюдение и са показали, че са свободни от антитела срещу вируса на Нюкасълската болест) в равен обем разтвор на Алсевер. Преди използването им клетките трикратно се промиват с PBS. За теста се използва 1% суспензия в PBS.
3. Като стандартен антиген се използва щам на НБП от вида "Ulster 2C".

Процедури

1. Във всяка ямка на микротитърната плака се накапват по 0,025 мл PBS (за предпочитане са V-образните дъна на ямките).
2. В първата ямка се поставят 0,025 мл вирусна суспензия (т.е. алантоисна течност).
3. След внимателно размесване от първата ямка се прехвърлят по 0,025 мл в следващата, след това от нея - в по-следващата и т.н., при което се получават двукратни разреждания на вируса, като се започва от 1:2 и се достигне до 1:4096.
4. Добавят се още 0,025 мл PBS във всяка ямка;
5. Добавят се по 0,025 мл 1% разтвор на еритроцити във всяка ямка.
6. Размесват се чрез внимателно потупване и се поставят при 4°С.
7. Контроли - положителна за аглутинация (две ямки, в които се поставят по 0,025 мл PBS, 0,025 мл неразредена вирусна суспензия и 0,025 мл еритроцити) и отрицателна за хемаглутинация (две ямки, в които се поставят по 0,050 мл PBS и по 0,025 мл еритроцити).
8. Плаките се разчитат след 30 - 40 мин. чрез накланянето им и отчитане наличието или липсата на отвесна черта, получена от стичането на еритроцитите. Ямките без хемаглутинация трябва да изглеждат по същия начин както контролните проби без вирус.
9. Хемаглутинационният титър представлява най-голямото разреждане, при което се предизвиква аглутинация на еритроцитите. Това разреждане се приема за 1 хемаглутинационна единица.
10. Реакция за задържане на хемаглутинацията

Реагенти

1. Изотоничен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (0,05 М) със стойност на рН между 7,0 и 7,4.
2. Алантоисна течност, съдържаща вируса на НБП, разредена с PBS, така че да съдържа 4 хемаглутинационни единици в единица обем.
3. 1% суспензия от кокоши еритроцити.
4. Негативен контролен кокоши серум.
5. Позитивен контролен серум.

Процедури

1. Във всяка ямка на микротитърната плака се накапват по 0,025 мл PBS (за предпочитане са V-образните дъна на ямките).
2. В първата ямка се поставят 0,025 мл от тествания серум.
3. След внимателно размесване от първата ямка се прехвърлят по 0,025 мл във следващата, след това от нея - в по-следващата и т.н., при което се получават двукратни разреждания на серума, като се започва от 1:2 и се достигне до 1:4096.
4. Добавят се по 0,025 мл разредена алантоисна течност, съдържаща 4 хемаглутинационни единици.
5. Смесват се чрез внимателно потупване и се поставят при 4°С за най-малко 60 мин. или на стайна температура за най-малко 30 мин.
6. Добавят се по 0,025 мл 1% суспензия на еритроцити във всяка ямка.
7. Смесват се чрез внимателно потупване и плаката се поставя при 4°С.
8. Плаките се разчитат след 30 - 40 мин., когато контролните червени кръвни телца са утаени. Чрез накланянето им се отчита наличието или липсата на отвесна черта, получена от стичането на червените кръвни телца по същия начин както контролните проби, съдържащи само еритроцити (0,025 мл) и PBS (0,05 мл).
9. Титърът на задържане на хемаглутинацията представлява най-голямото разреждане на антисерума, предизвикващо пълна инхибиция на 4 хемаглутинационни единици вирус (при всеки тест за задържане на хемаглутинацията се извършва предварително титриране на вирусната суспензия и определяне на 4 ХАЕ).
10. Резултатите се считат за валидни, ако при отрицателния серум се получи титър 23или по-малък при 4 хемаглутинационни единици на вируса, а при положителния контролен серум се получи титър с най-много едно разреждане разлика от известния му титър.
11. Определяне на интрацеребрален патогенен индекс
12. Инфекциозна прясна алантоисна течност (хемаглутинационният титър трябва да е по-голям от 24) се разрежда 1:10 в стерилен изотоничен физиологичен разтвор (без антитела).
13. От разредения изолат на вируса се инокулират интрацеребрално по 0,05 мл в 10 еднодневни пилета (40 часа след излюпване). Пилетата трябва да са получени от яйца, получени от специфично, свободно от патогенни микроорганизми птиче стадо.
14. Птиците се наблюдават в продължение на 8 дни на 24-часови интервали.
15. При всяко наблюдение птиците се маркират по следния начин: 0 = норма; 1 = болни; 2 = мъртви.
16. Индексът се пресмята по следния начин:
17. Оценка на способността за формиране на плаки
18. Използват се десетократни разреждания до 10-7в изотоничен физиологичен разтвор, буфериран с фосфат, за да се получат най-ясни плаки.
19. В петриеви панички се приготвят плътни монослоеве от клетки на кокоши ембриони или подходяща клетъчна линия (Мадин-Дарби говежди бъбреци) в диаметър 5 см.
20. По 0,2 мл от всеки разреден вирусен изолат се добавят към петриевите панички и се оставя да се абсорбира за 30 мин.
21. След трикратно измиване в изотоничен PBS разтвор заразените клетки се покриват със среда, съдържаща 1% агар, 0,01 мг/мл трипсин (или без трипсин). В посочената среда не се добавя серум.
22. След 72-часова инкубация при 37°С получените плаки трябва да са с достатъчен размер. Те се визуализират най-добре, когато покривният агар се отстрани и клетъчният монослой се боядиса с кристал виолет (0,5%) в 25% етанол.
23. Всички вируси трябва да дадат ясни плаки, когато се инкубират с трипсин в покривния слой. Когато не се добавя трипсин, само вируси, вирулентни за пилета, ще образуват плаки.

Приложение № 4а къмчл. 22, ал. 1 (Ново - ДВ, бр. 8 от 2010 г., в сила от 29.01.2010 г.) Национална референтна лаборатория за псевдочума: България Национална референтна лаборатория - Изпитвателна лаборатория "Екзотични и особено опасни инфекции" към Национален диагностичен научноизследователски ветеринарномедицински институт (НДНИВМИ) София, бул. Ломско шосе 190.

Приложение № 5 къмчл. 22, ал. 2, т. 8 (Доп. - ДВ, бр. 76 от 2006 г., предишно Приложение № 5 към чл. 22, ал. 2, т. 7, изм. - ДВ, бр. 8 от 2010 г., в сила от 29.01.2010 г., отм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 01.01.2019 г.)

Приложение № 6 къмчл. 11, т. 2 (Отм. - ДВ, бр. 64 от 2018 г., в сила от 01.01.2019 г.)